基准医疗文章速递：结直肠癌早期诊断cfDNA甲基化模型的探索

基准医疗多癌种早筛系列报道-结直肠癌篇

基准医疗（AnchorDx）与中山大学附属第六医院的兰平教授和吴现瑞教授团队在Molecular Oncology（影响因子: 6.574）发表了一篇题为“A novel cell-free DNA methylation-based model improves the early detection of colorectal cancer”的研究论文。

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结直肠癌（CRC）是全球第三大最常见的恶性肿瘤，尽管治疗方法有所改善，但TNM晚期CRC患者的预后仍较差。I期CRC患者的5年生存率为91%，而IV期仅为14%。因此，对早期CRC的精准筛查是降低CRC相关死亡率的关键策略之一。

目前，CRC筛查方法主要分为有创结肠镜检查和无创大便CRC筛查，有创结肠镜检查存在对技术和设备要求高、检查前需要彻底清洁肠道、侵入性检查会带来一定的痛苦和并发症风险、患者依从性差等问题；而无创大便CRC筛查存在假阳性率高、非必要的治疗、价格相对较高、缺乏长期随访研究数据等问题，现阶段迫切需要一种高灵敏度和特异度的无创性CRC筛查产品。

本项目研究通过187个组织DNA样本（91个非恶性组织，26个进展期腺瘤[AA]和70个CRC）和489个血浆cfDNA样本进行靶向DNA甲基化测序，建立并验证了用于AA和早期CRC非侵入性检测的基于11个DNA甲基化生物标志物的cfDNA甲基化模型。

1、研究工作流程

为鉴定结直肠癌（CRC）特异的DNA甲基化生物标志物，研究者收集了313个组织样本（139例正常，30例进展期腺瘤[AA]和144例结直肠癌[CRC]）进行靶向DNA甲基化二代测序（NGS）。此外，为进一步探索这些DNA甲基化标志物在CRC早期检测中的临床应用，采集了577例血浆样本（169例健康对照组、44例非进展期腺瘤[NAA]、76例AA和288例CRC）进行NGS测序分析。经过DNA提取、文库构建和DNA甲基化测序的质控，最终分析了187个组织样本和489个血浆样本。应用Wilcoxon检验和Benjamini-Hochberg多重检验筛选组织队列，得到了667个CRC特异的DNA甲基化生物标志物。将133例正常血浆样本和248例CRC血浆样本随机分组到训练和验证集中，进行建模分析，从该667个生物标志物中进一步筛选CRC特异甲基化生物标志物。在LASSO选择后，基于训练集获得11个CRC特异性甲基化生物标志物，然后使用验证集进一步确认。最终，通过对NAA、AA和CRC患者的诊断来评估该模型的临床价值。同时，通过与癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原19-9（CA19-9）方法的比较，评估了该模型在CRC管理中的稳定性。（Figure 1）

Figure 1. The study workflow chart.

2、健康对照组、NAA、AA和CRC患者的cfDNA提取分析

比较551例（162例健康对照[正常]、44例非进展期腺瘤[NAA]、74例进展期腺瘤[AA]、69例结直肠癌I期[I]、97例结直肠癌II期[II]、70例结直肠癌III期[III]、35例结直肠癌IV期[IV]）cfDNA质控合格的样本的cfDNA浓度。数据显示为平均值±标准差（SD）；ns，不显著（Figure 2，***p<0.001；****p<0.0001）。

Figure 2. The cfDNA extraction analysis in healthy controls, NAA, AA, and CRC patients.

3、组织DNA甲基化图谱的表征

187个组织样本中667个结直肠癌（CRC）特异DNA甲基化生物标志物的无监督分层聚类分析（Figure 3A）。CRC、进展期腺瘤（AA）和正常样本的主成分分析（Figure 3B）。CRC与AA组甲基化模式的相关性分析（Figure 3C）。基于9921个生物标志物计算平均甲基化水平。图中的值是与正常样本共甲基化值（PCM）的比值，然后进行Log2转换来生成的。

Figure 3. Characterization of the tissue DNA methylation landscape.

4、cfDNA甲基化模型检测腺瘤和CRC患者的性能和风险评分

在训练和验证集中，模型的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.90（0.85-0.94）和0.92（0.88-0.96）（Figure 4A-B）。应用于腺瘤患者的诊断时，该模型在腺瘤、非进展期腺瘤（NAA）和进展期腺瘤（AA）中分别达到0.82（0.76-0.87）、0.77（0.69-0.86）和0.85（0.78-0.91）（Figure 4C-E）。该模型在I期结直肠癌检测中的AUC为0.90（0.86-0.95）（n=199）（Figure 4F）。该模型在结直肠癌（CRC）患者的诊断中表现突出，AUC为0.91（0.88-0.94）（n=381）（Figure 4G）。在CRC和AA队列（n=449）的检测中，模型的总体AUC为0.90（0.87-0.93）（Figure 4H）。模型在健康对照（正常）和NAA、AA以及结直肠癌I-IV期患者中的风险评分（n=489，配对t检验；Figure 4I，*****p<0.0001）。

Figure 4. The performance and risk score of the cell-free DNA methylation model in detecting adenoma and CRC patients.

5、cfDNA甲基化模型与肿瘤生物标志物CEA和CA19-9的CRC诊断性能比较

cfDNA甲基化模型、癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原19-9（CA19-9）检测结直肠癌（CRC）的ROC曲线下面积分别为0.91（0.88-0.94）、0.77（0.72-0.82）和0.59（0.53-0.65；Figure 5）。

Figure 5. Comparison of CRC diagnostic performance between the cfDNA methylation model and the tumor biomarker CEA and CA19-9.

本研究建立并验证了用于AA和早期CRC非侵入性检测的基于11个DNA甲基化生物标志物的cfDNA甲基化模型。我们收集了来自CRC、进展期腺瘤（AA）、非进展期腺瘤和健康对照组的313个组织和577个血浆样本，去除质控不合格的，选择187个组织DNA样本（来自CRC患者的91个非恶性组织，26个AA和70个CRC）和489个血浆cfDNA样本进行靶向DNA甲基化测序。在训练队列中基于11个甲基化生物标志物（ROC曲线下面积[AUC]=0.90[0.85-0.94]）开发了一个用于CRC检测的cfDNA甲基化模型，该模型在验证队列（AUC=0.92[0.88-0.96]）中得到验证。本研究建立的cfDNA甲基化模型能够稳定地诊断出早期CRC（AUC=0.90[0.86-0.95]）或AA（AUC=0.85[0.78-0.91]）的患者。该模型将在CRC的早期诊断临床实践中发挥着积极作用。

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编译者/作者：商业周刊

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